正痘病毒属包含许多可在人类和动物中引起严重痘病的病毒，包括猴痘病毒（MPXV）、牛痘病毒（CPXV）和最著名天花病毒（VARV）。虽然经过历史性的全球疫苗接种运动，天花于1980年正式在世界范围内根除，但正痘病毒感染仍然是一个重大的公共卫生威胁。直到今天，多国猴痘疫情仍在继续。作为一种DNA病毒，MPXV理论上不会像RNA病毒那样频繁变异。然而、在近期猴痘疫情的基因组中新发现了适应性突变。因此，在全球猴痘疫情的背景下，不能排除MPXV进一步适应性突变并导致更大规模疫情爆发的可能性，我们迫切需要制定有效的治疗策略来对抗正痘病毒。 

　　迄今为止已经开发了多种治疗方法，包括抗病毒抑制剂、人牛痘免疫球蛋白（VIG）和痘病毒特异性单克隆抗体。越来越多的证据表明痘病毒抗体在病毒控制和原发和继发感染恢复中的重要性。治疗性单克隆抗体的开发代表了预防或治疗正痘病毒感染的有前途策略，目前靶向VACV A33、VACV B5、MPXV M1和VACV A27这四种原始蛋白的单克隆抗体在研究中表现出对几种正痘病毒（包括VACV、CPXV、MPXV和VARV）广泛的交叉中和活性。 

　　2024年3月27日，军事科学院邓永强、秦成峰研究团队联合艾博生物在Nature子刊Signal Transduction and Targeted Therapy上发表了题为“Rapid development of double-hit mRNA antibody cocktail against orthopoxviruses”的研究论文。本研究首次报告了具有体内保护作用的针对正痘病毒的mRNA抗体疗法，通过脂质纳米颗粒（LNP）封装的mRNA平台，构建了一组编码针对正痘病毒的广泛中和抗体的mRNA。单次静脉注射每种mRNA抗体均可在小鼠体内迅速产生有效的中和抗体。更重要的是，靶向EEV型和IMV型病毒的双打击（double-hit）mRNA抗体组合（Cocktail）Mix2a在小鼠中显示出对致命VACV攻击的卓越保护效力。 

　　编码正痘病毒抗体mRNA的构建和表征 

　　研究团队首先选择了四种经验证具有广泛交叉中和活性的抗体mAb22、mAb283、mAb26和mAb301，分别靶向VACV-A33、VACV-B5、MPXV-M1和VACV-A27蛋白。接着优化每种候选单克隆抗体的重链（HC）和轻链（LC）编码序列，并分别插入质粒ABOP-028中。制备所得的mRNA包含5'帽、5'UTR、信号肽、候选mAb密码子优化编码序列、3'UTR和poly(A)尾（图1a）。 

　　图1. 编码正痘病毒抗体mRNA的构建和表征 

　　LNP-mRNA体内表征 

　　将四种编码抗体的mRNA组合后包封为LNP制剂，分别为mRNA-mab22-LNP、mRNA-mab283-LNP、mRNA-mab26-LNP和mRNA-mab301-LNP。动态光散射分析显示粒径均匀，范围为73.12至75.39 nm，多分散系数（PDI）低于0.1。使用ELISA评估小鼠血清中的人IgG浓度，血清人IgG的浓度范围为269-2598 ng/mL（图2）。 

　　图2. LNP-mRNA体内表征 

　　为了进一步确定这些mRNA抗体是否有效，在BS-C-1细胞中使用VACV EEV和IMV进行了斑块减少中和试验（PRNT）。mRNA-mab22-LNP和mRNA-mab283-LNP注射小鼠的血清中测得高水平的抗EEV中和抗体而mRNA-mab26-LNP和mRNA-mab301-LNP注射有助于中和VACV的IMV形式，其中EEV候选药物的中和滴度远高于IMV候选药物，因此推测EEV候选药物对于卓越的保护效果至关重要。 

　　 对VACV感染的保护效率 

　　由于肺组织是感染VACV的小鼠的主要感染器官，因此在BS-C-1细胞中使用标准斑块测定进一步测定了感染小鼠肺部的感染性病毒颗粒。用mRNA-mab22-LNP处理可完全控制肺部VACV复制，没有可检测到的传染性病毒颗粒。此外，使用H&E染色和免疫组化（IHC）分析对病理性肺部病变进行了研究。结果显示，VACV感染导致对照组小鼠上皮内膜轻度至显著弥漫性变性和坏死（黑色箭头），伴有出血、水肿（红色箭头）和纤维蛋白渗出到周围肺泡（蓝色箭头），而mRNA编码的抗体治疗（mRNA-mab283-LNP除外）显著阻止了VACV诱导的肺损伤（图3）。此外，使用抗VACV D8单克隆抗体进行的IHC分析显示，对照组小鼠肺中D8L蛋白阳性细胞，而mRNA抗体治疗组的肺组织中未检测到病毒蛋白阳性细胞。 

　　图3. 对VACV感染的保护效率研究 

　　双打击mRNA组合有助于实现卓越保护力 

　　为了确定中和IMV型和EEV型病毒的最佳双命中mRNA抗体混合物，相应地制备了两种候选药物，分别称为Mix2a（mRNA-mab22-LNP加mRNA-mab26-LNP）和Mix2b（mRNA-mab283-LNP和mRNA-mab26-LNP） 

　　实验显示，Mix2a和Mix2b有助于对EEV形式和IMV形式的VACV进行功能性中和，Mix2a产生的功能抗体水平高于Mix2b，两者都可以保护小鼠在感染致死剂量的VACV后免于体重减轻，完全阻止了VACV诱导的病理性肺部病变，通过IHC分析未检测到病毒蛋白阳性细胞。 

　　这些结果表明，对正痘病毒感染的最佳保护需要EEV和IMV靶向中和抗体的合作，并强调Mix2a是当前研究中最有效的双打击mRNA抗体组合候选物。 

　　图4. 双打击mRNA抗体组合有助于提高保护效率 

　　总结 

　　总体而言，单次注射mRNA抗体混合物Mix2a可防止小鼠感染正痘病毒。采用定制mRNA的人类抗体组合代表了一种很有前途的抗病毒策略，可以快速响应以对抗当前和未来的人类痘病毒爆发。 

　　需要注意的是，本研究制剂思路中，需要将编码轻链和重链的两个mRNA封装到LNP制剂中，而同源轻链和重链的正确配对对于抗体功能至关重要，这使得多组分mRNA抗体比多组分mRNA疫苗更为复杂。此外，研究发现，同时施用不同的mRNA表达抗体可能会导致功能性抗体的生产效率低下，Mix2a和Mix2b组的功能性抗体较单一抗体施用所获得的水平略低，存在一定抗体干扰问题。因此，需要进一步研究确定不同mRNA抗体间的相互作用以及对功能影响的具体机制。 

　　（来源： RNAScript） 

　　原文出处：Chi H, Zhao SQ, Chen RY, Suo XX, Zhang RR, Yang WH, Zhou DS, Fang M, Ying B, Deng YQ, Qin CF. Rapid development of double-hit mRNA antibody cocktail against orthopoxviruses. Signal Transduct Target Ther. 2024 Mar 27;9(1):69. doi: 10.1038/s41392-024-01766-8. PMID: 38531869; PMCID: PMC10966106.