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寨卡病毒实验室检测技术方案

2016-03-29

  寨卡病毒(Zika Virus)属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus),呈球形,直径约为40-70nm,有包膜。基因组为单股正链RNA,长度约为10.8Kb,可分为亚洲型和非洲型两个基因型。 

  寨卡病毒病的检测方法包括病毒核酸检测、IgM抗体检测、中和抗体检测和病毒分离等。寨卡病毒与黄病毒属其他病毒具有较强的血清学交叉反应,目前主要采用病毒核酸检测。 

  一、检测对象 

  (一)疑似和临床诊断病例。 

  (二)伊蚊成蚊和幼虫。 

  二、样本采集、保存和运输 

  (一)病例标本采集 

  对怀疑感染寨卡病毒的患者,要尽早采集血标本,同时要采集尿液和唾液标本。如果临床高度怀疑男性为寨卡病毒病,在上述标本无法确诊时,可考虑采集精液开展检测。 

  血液标本采集办法:用无菌真空干燥管,采集患者非抗凝血5 ml,及时分离血清,分装2管,保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内,标记清楚后低温保存,其中1管用于现场实验室检测,1管用于上级疾病预防控制机构复核。对病例应尽可能采集双份血液标本,两份标本之间相隔14天为宜,住院病例可于入院当天和出院前1天各采集一份。 

  尿液标本的采集方法:采集尿液标本10ml,置于无菌50ml塑料尖底离心管中,2000rpm离心5min去沉淀,将上清液分装至无菌15ml离心管中,每份5 ml。如需采集精液标本,应在采集精液标本前采集尿液标本。 

  唾液标本的采集方法:将唾液吐入50ml塑料尖底离心管中,4000rpm离心15min去沉淀,将离心后上清液分装,分装2管,每份1 ml,保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内后保存。 

  采集精液开展实验室检测时,需采集标本12 ml,置于无菌干燥、带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内后保存。 

  (二)蚊媒标本采集 

  疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫,分类鉴定后,填写媒介标本采集信息表,按照采集地点分装,每管1020只。 

  (三)标本保存、运送 

  如标本能够在24小时内开展实验室检测,应将标本置于28℃保存;不能及时检测的标本应尽快置于-70℃以下保存。 

  标本运送时采用低温冷藏运输,避免冻融,样本运输应遵守国家相关生物安全规定。 

  三、检测方法 

  寨卡病毒病的检测方法包括病毒核酸检测、IgM抗体检测、中和抗体检测和病毒分离等。寨卡病毒与黄病毒属其他病毒具有较强的血清学交叉反应,目前主要采用病毒核酸检测。 

  开展蚊媒寨卡病毒检测时,主要对捕获的伊蚊成蚊或幼虫进行病毒核酸检测和病毒分离。 

  开展寨卡病毒实验室检测时,应同时考虑登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能。登革病毒和基孔肯雅病毒实验室检测应按照相应的技术指南开展。 

  (一)临床标本检测 

  1.病原学检测 

  病原学检测主要适用于急性期血液标本,一般认为发病7天内检测阳性率高。 

  1)核酸检测:采用荧光定量RT-PCR方法,是目前早期诊断寨卡病毒病的主要检测手段。可采用中国疾病预防控制中心病毒病所发放的荧光定量PCR试剂或其他商品化试剂盒进行检测。 

2)病毒分离:将标本接种于蚊源细胞(C6/36)或哺乳动物细胞(BHK21Vero)进行分离培养,出现病变或57天以后,用检测核酸的方法鉴定病毒。也可使用乳鼠脑内接种进行病毒分离。 

  2.血清学检测 

  1)血清特异性IgM抗体:发病3天后可检出病毒特异性IgM抗体,但发病7天后检出率高。可采用ELISA、免疫荧光等方法检测。IgM抗体阳性,提示患者可能新近感染寨卡病毒,但寨卡病毒IgM抗体与登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒等黄病毒有较强的交叉反应,易于产生假阳性。 

  2)中和抗体:采用空斑减少中和试验方法检测。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高,且排除登革、乙脑等其他常见黄病毒感染,可以确诊。 

  3.其他标本检测 

  尿液、唾液和精液标本的检测可用血清病毒RNA提取试剂盒及核酸特异性检测试剂进行检测,结果判定同血清标本。 

  (二)媒介标本检测 

  1.标本处理 

  将分类后的伊蚊成蚊或幼虫,按照采集地点,每1020只为一份进行研磨处理。 

  2.病毒核酸检测 

  RT-PCR的方法进行寨卡病毒核酸检测。 

  3.病毒分离 

  病毒核酸阳性的标本进行病毒分离。 

  四、生物安全 

      寨卡病毒按照第三类病原微生物进行管理。凡涉及寨卡病毒的分离、培养、未经培养的感染材料等的操作应在生物安全二级(BSL-2)实验室进行;灭活材料和无感染性材料的操作可在生物安全一级(BSL-1)实验室进行。病毒培养物的运输应满足国际民用航空组织公布的《危险物品安全航空运输技术细则》(Doc9284号文件)A类感染性物资的包装要求,对应的联合国编号为UN2814;未经培养的感染性材料(包括患者血、尿液、唾液或动物体液标本以及现场采集的媒介生物标本等)运输时应满足B类感染性物质的包装要求,对应的联合国编号为UN3373。开展相关运输活动须按照原卫生部发布的第45号令《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》进行审批后,方可实施运输。 

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