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人杯状病毒的检测

2007-01-11

一、ELISA检测人杯状病毒

采用IDEIA™ Norovirus试剂盒(DakoCytomation公司),仅限于检测人杯状病毒中的诺如病毒(属)GⅠGⅡ型。

(一)检测前准备工作

1.粪便标本处理:加入1ml样品稀释液(sample diluent)至1.5ml EP管中,加入0.1g固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本,置于漩涡震荡器混匀,室温静置10min,室温下≥5000rpm离心5min

2.阴性对照:将1ml样品稀释液(sample diluent)加至标记好的小瓶中作为阴性对照。

3.阳性对照:1ml对照稀释液(control diluent)溶解阳性对照,使用前混匀。

4.洗液的配制:1倍体积的洗液浓缩液,加9倍体积的去离子H2O。当天用当天配。

(二)标本检测

1.    将需要数量的微孔板置于微孔板架上。

2.    每孔加入100µl 10%便悬液或阴性对照或阳性对照(每次检测均需加一个阳性对照和一个阴性对照)2030℃静置60±5min

3.    每孔加入2滴(或100µl)酶结合物(conjugate),用枪头轻柔混匀。

4.    每孔加入350µl洗液,洗5次,在卫生纸上拍干。

5.    每孔加入2滴(或100µl)底物液(Substrate),2030℃静置30min。待蓝色显现后迅速观察颜色。

6.    每孔加入2滴(或100µl)终止液(Stop solution),充分混匀。

7.    读取OD450值,打印输出或记录OD值。结果必须在加入终止液后30min内读取。

() 检测结果的判定:

1.    阴性对照:肉眼观察无色或OD450<0.15

2.    临界值:OD450值=阴性对照OD450值+0.10

3.    阳性对照:肉眼观察呈现独特的蓝色或OD450>0.50

4.    标本:肉眼观察蓝色比阴性对照颜色深判定为阳性,肉眼观察无色判定为阴性;或者OD450值大于临界值判定为阳性,小于临界值判定为阴性,OD450值在临界值±0.01范围内判定为可疑,应重复检测。

(四)注意事项:

1.打开后的96微孔板应置于可封口的有干燥剂的口袋中贮存于28℃,打开后6周内用完。

2.终止液中含0.3mol/L硫酸,避免接触到皮肤和粘膜。如果终止液接触到这些部位立即用水冲洗。

3.未用完的阳性对照可在28℃贮存1个月,长期贮存应分装存于-20℃

4.底物液避光保存,不要使用已经变蓝的底物液。

5.避免污染。

二、人杯状病毒RT-PCR检测

可以同时检测出人杯状病毒中诺如病毒(属)和扎如病毒(属)。

(一)病毒RNA提取:

1.提取前的准备工作:

(1)    1ml Buffer AVL加入装有低压冻干的Carrier RNA中,彻底溶解Carrier RNA后,将溶有Carrier RNABuffer AVL转入至Buffer AVL瓶中,彻底混匀。分装贮存于28℃。如果在28℃时,Buffer AVL/Carrier RNA溶液形成沉淀,可在80℃重新溶解,注意加热的时间不能超过5min,用前冷却至室温。Buffer AVL/ Carrier RNA溶液不能加热超过6次。

(2)    加入合适比例的96100%的酒精至Buffer AW1中,19mlBuffer AW1加入酒精25ml

(3)    加入合适比例的96100%的酒精至Buffer AW2中,13mlBuffer AW2加入酒精30ml

2.病毒RNA的提取:

(1)    1.5ml EP管中加入560µl 已加入Carrier RNABuffer AVL

(2)    140µl 10%便悬液加入至EP管中的Buffer AVL中,vortex混匀15sec

(3)    室温(1525℃)孵育10min

(4)    1.5ml EP管轻微离心,以去除管内的液滴。

(5)    在管内加入560µl 96100%的酒精,vortex混匀15sec。混匀后,将1.5ml EP管轻微离心,以去除管内的液滴。

(6)    小心的将630µl步骤5中的溶液加入至已放入至2ml收集管中的QIAamp离心柱中,注意不要弄湿柱子边缘。盖上盖子,8000rmp离心1min。将QIAamp离心柱放置至另一干净的2ml收集管中,弃去包含有滤过液的收集管。

(7)    小心打开QIAamp离心柱的盖子,重复步骤6

(8)    小心打开QIAamp离心柱的盖子,加入500µl Buffer AW1。盖上盖子,8000rmp离心1min。将QIAamp离心柱放置至另一干净的2ml收集管中,弃去包含有滤过液的收集管。

(9)    小心打开QIAamp离心柱的盖子,加入500µlBuffer AW2。盖上盖子,14,000rmp离心3min。弃去收集管中的滤过液,14,000rmp离心空柱子1min

(10)QIAamp离心柱放置入干净的1.5ml离心管中。弃去包含有滤过液的收集管。小心打开QIAamp离心柱的盖子,加入60µl Buffer AVE至离心柱中,盖上盖子,室温孵育1min8000rmp离心1min。(2×40µlBuffer AVE洗脱两次,能增加产量。)病毒RNA进行反转录,或贮存于-20℃或-70℃备用。

(二)人杯状病毒ssRNA的反转录:

0.2mlEP管中配制如下逆转录体系。

10×缓冲液                        2.5 µl

25 mM MgCl2                        4 µl

2.5mM dNTPs                         5µl

1% BSA                                2.5µl

0.2 µg/ µl引物289混合液        1µl

10 U/µl AMV-RT                0.35µl

50 U/µl RNasin                      0.1µl

DEPC处理H2O                  8.05µl

RNA                                      1.5µl

25µl,混匀,轻微离心,42℃反转录1hr

(三)人杯状病毒cDNA PCR扩增

0.2ml EP管中配制如下PCR体系:

10×缓冲液        5µl

25mM MgCl2        4µl

10mM dNTPs        1µl

0.2 µg/ µl引物289混合液  1µl

0.1µg/ µl引物290混合液  1µl

5 U/µl Taq      0.4 µl

DEPC处理H2O       29.6µl

cDNA             8µl

50µl,混匀,轻微离心,放入PCR仪中扩增,反应条件:94℃变性3min后,94℃ 60s58℃1min20s72℃1min,进行30个循环,72℃延伸10min。反应结束后1.5%琼脂糖凝胶电泳或4℃保存PCR产物。

1  人杯状病毒RT-PCR所用的引物

引物

位置

方向

核酸序列(5’3’)

289H

4865-4886

-

TGACGATTTCATCATCACCATC

289I

4865-4886

-

TGACGATTTCATCATCCCCGTC

290H

4568-4590

+

GATTACTCCAGGTGGGACTCCAC

290I

4568-4590

+

GATTACTCCAGGTGGGACTCAAC

290J

4568-4590

+

GATTACTCCAGGTGGGATTCAAC

290K

4568-4590

+

GATTACTCCAGGTGGGATTCCAC

(四)检测结果的判定:

15µl RT-PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。人杯状病毒诺如属扩增产物大小为319bp,扎如属扩增产物大小为331bp

(五)注意事项:

1.    枪头避免触及QIAamp离心柱的滤过膜。

2.    避免污染。应该戴手套进行操作。PCR实验室应该分为3个区:试剂准备区,样品准备区,扩增和检测区。

3.    EB可能致癌,必须小心操作,划定EB污染区。

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