MARCHs（membrane associated RING-CH proteins）是一类膜E3泛素连接酶。该类蛋白的N端含有C4HC3 RING-finger结构域，能够结合E2结合酶，泛素化修饰底物分子^[1]。目前该家族共发现11个成员，MARCH8属于胞内MARCH家族的一员，能够下调MHC（major histocompatibility complex）Ⅱ，CD86和IL（interlukin）-1受体辅助蛋白等多种细胞膜蛋白的表达，是一种重要的免疫调节蛋白^[2-4]。 

　　近年研究发现，MARCH8能够抑制VSV和HIV复制^[5,6]。目前对于MARCH8抑制病毒复制的机制研究认为，MARCH8能够下调病毒包膜蛋白在质膜上的分布，减少病毒颗粒中包膜蛋白的插入，降低其感染性^[7]。2021年5月，中国医学科学院病原生物学研究所郭斐实验室已在Hum Gene Ther. 杂志发表题为The Engineered MARCH8-Resistant Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein Enhances Lentiviral Vector Transduction的文章，根据MARCH8靶向降解VSV-G蛋白的特性，设计了一种携带K<R突变的VSV-G载体，使用该载体能够显著增强VSV-G包装的假病毒颗粒的转导活性，可应用于CAR-T等肿瘤体外过继免疫治疗。 

　　2021年7月20日，郭斐实验室和王健伟实验室在Nature communication上发表了题为MARCH8 inhibits influenza A virus infection by targeting viral M2 protein for ubiquitination-dependent degradation in lysosomes的论文，进一步阐释了MARCH8作为宿主限制因子抑制IAV复制的作用及其分子机制。 

　　作者首先利用慢病毒包装体系，检测了MARCH8对于流感病毒包膜蛋白功能的影响，发现MARCH8能够显著降低M2蛋白在细胞中的表达丰度。通过感染MARCH8过表达和敲除的细胞系，作者进一步证实MARCH8能够靶向降低病毒感染后M2蛋白在细胞中尤其是在细胞质膜上的表达丰度。 

　　利用PPMO敲降小鼠肺脏中的MARCH8蛋白表达，作者发现MARCH8能够抑制流感病毒在小鼠体内的复制。后续实验发现其作用机制是通过泛素化M2蛋白，促进质膜上的M2蛋白内吞并经溶酶体途径降解，降低M2蛋白在质膜上的分布，进而阻断病毒颗粒的释放。 

　　MARCH8介导底物分子的降解，依赖于底物分子胞内区的赖氨酸残基^[8]。M2蛋白的胞内区含有四个赖氨酸残基，分别为K49，K56，K60和K78。因此，我们分别对四个赖氨酸残基分别进行单个或全部突变，获得五个M2 K>R突变体。比较野生型M2和K>R突变M2被MARCH8泛素化修饰和降解情况发现，M2的K78位点是MARCH8的主要作用靶点。 

　　通过构建携带K78R突变的IAV病毒株，证实突变病毒株在细胞和小鼠体内具有更好的复制能力。进一步分析K78位点在流感病毒中的保守性，作者发现H1N1的流行株通过获得78/79位点非赖氨酸的突变，逃逸MARCH8的抗病毒作用 。 

　　总之，该研究发现MARCH8能够抑制流感病毒复制，并且证实了其作用靶点是流感病毒的M2蛋白。MARCH8通过介导M2 胞内区K78位点的泛素化修饰，促进M2蛋白经过溶酶体途径降解，减少M2蛋白在质膜上的分布，从而削弱M2辅助流感病毒释放的功能。此研究同时发现构建的K78R突变流感病毒株能够逃逸MARCH8的抑制作用。并通过分析K78位点在流感病毒M2蛋白中的保守性发现，M2 蛋白78位点的赖氨酸逐渐被非赖氨酸突变替代，提示在流感病毒的进化中， M2 K78位点的突变可能通过逃逸宿主的限制获得复制优势。该研究阐释了宿主内源性免疫在流感病毒适应性突变产生中的作用机制, 从宿主选择压力的角度揭示流感病毒的致病机理和逃逸机制，可以为抗流感的药物研发提供新的可能靶点，为治疗和延缓病毒感染引发的疾病提供新的手段和方法，同时相关结果可以为重配高产流感病毒疫苗株的改造提供了新的理论基础。 

　　中国医学科学院病原生物学研究所博士后刘晓满，副研究员许丰雯和研究员任丽丽为论文共同第一作者。中国医学科学院病原生物学研究所郭斐研究员和王健伟研究员为共同通讯作者。同时，该研究得到了中国疾病与预防控制中心病毒病预防控制所宋敬东副研究员,中国医学科学院病原生物学研究所赵振东研究员, 中国医学科学院医药生物技术研究所岑山研究员及加拿大麦吉尔大学梁臣教授的大力支持。 

   （来源：BioArt） 

　　参考文献： 

　　1. Goto, E. et al. c-MIR, a human E3 ubiquitin ligase, is a functional homolog of herpesvirus proteins MIR1 and MIR2 and has similar activity. The Journal of biological chemistry 278, 14657-14668 (2003). 

　　2. von Rohrscheidt, J. et al. Thymic CD4 T cell selection requires attenuation of March8-mediated MHCII turnover in cortical epithelial cells through CD83. The Journal of experimental medicine 213, 1685-1694 (2016). 

　　3. Liu, H. et al. Ubiquitin ligase MARCH 8 cooperates with CD83 to control surface MHC II expression in thymic epithelium and CD4 T cell selection. The Journal of experimental medicine 213, 1695-1703 (2016). 

　　4. Chen, R., Li, M., Zhang, Y., Zhou, Q. & Shu, H.B. The E3 ubiquitin ligase MARCH8 negatively regulates IL-1beta-induced NF-kappaB activation by targeting the IL1RAP coreceptor for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 14128-14133 (2012). 

　　5. Yu, C. et al. MARCH8 Inhibits Ebola Virus Glycoprotein, Human Immunodeficiency Virus Type 1 Envelope Glycoprotein, and Avian Influenza Virus H5N1 Hemagglutinin Maturation. mBio 11 (2020). 

　　6. Tada, T. et al. MARCH8 inhibits HIV-1 infection by reducing virion incorporation of envelope glycoproteins. Nature medicine 21, 1502-1507 (2015). 

　　7. Zhang, Y. et al. MARCH8 inhibits viral infection by two different mechanisms. eLife 9 (2020). 

　　8. Walseng, E. et al. Ubiquitination regulates MHC class II-peptide complex retention and degradation in dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 20465-20470 (2010). 

　　链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-24724-2