人偏肺病毒（Human metapneumovirus，hMPV）发现于2001年，是引起急性下呼吸道感染的主要病原之一。hMPV的初次感染通常发生在5岁以下，约6%-40%的儿童住院和门诊是由其引起的，仅次于呼吸道合胞体病毒（RSV）^[1]。hMPV可反复感染，在成人（特别是在老年人和免疫缺席患者）中引起严重疾病，住院率堪比RSV和流感病毒。目前hMPV尚无预防性疫苗或抗病毒特效药物获批。hMPV在序列、结构、疾病进程上与RSV有诸多相似之处，而RSV已有获批的治疗性单抗palivizumab，更多的抗体和疫苗正在进行临床试验。因此，RSV的成功实践无疑可为hMPV的防治提供借鉴。 

　　hPMV的囊膜外共有3种糖蛋白——粘附蛋白（G）、小疏水蛋白（SH）及融合蛋白F，其中F是感染必需的，也是中和抗体的唯一靶蛋白^[2]。在成熟粒子表面，F呈三聚体形式，每个单体先被合成为一个无活性的前体蛋白F₀，随后被酶切为共价连接的两个亚基F1、F2。 

　　2022年8月8日，美国田纳西大学奥斯丁分校的Jason S. McLellan和Adagio Therapeutics公司的Laura M. Walker合作领导的研究组在Immunity发表研究论文Potently neutralizing and protective anti-human metapneumovirus antibodies target diverse sites on the fusion glycoprotein，通过对记忆B细胞的高通量单细胞测序，发现数百种靶向融合前（preF）和融合后（postF）状态的F抗体，靶向preF三聚体上一个敏感位点的抗体被证明是高度有效的中和抗体，3种靶向不同表位的中和抗体单一治疗均可在小动物水平提供有效保护。 

　　具体来说，作者首先收集16位健康人的血清和外周血单核细胞（PBMC），其中8位年龄在65岁之上，8位年龄在21-27岁之间。体外结合试验显示两个年龄组样品在结合F蛋白及中和活性上无显著差别。由于只有靶向F的抗体才可能有中和活性，因此作者使用流式细胞仪分离特异性结合preF的B细胞；而由于RSV与hMPV的相似性，作者还检测了可以同时结合RSV和hPMV的B细胞。 

　　接着，作者选择其中与hMPV preF反应最强的3位年长及3位年轻供者的PBMC进行单细胞分选及测序，共计获得435个IgG1单抗，将其逐一在酵母细胞中表达、纯化，经生物膜干涉（BLI）检测，确认其中375个抗体可结合hMPV F。序列分析显示，上述抗体来源的记忆B细胞在不同供体间高度差异，抗体本身也来源于不同的克隆分支。 

　　然后使用BLI测试抗体对hMPV preF和postF的亲和力，发现其中62%（236/375）的抗体只结合preF，其余抗体除一个外均可同时结合两种状态的F，尽管它们大多存在亲和力偏好性。每位供者抗体中只有不超过3.5%可同时结合RSV preF，这种具备交叉结合能力的抗体显示出更高的体细胞突变（SHM），暗示当供者再接触RSV或hMPV时，这些B细胞被重招募至次级生发中心。 

　　中和实验显示，26%的抗体在5μg/ml浓度时具备中和活性，而此前对preF亲和力较高的抗体通常仅显示弱的或无中和活性，但特异性结合perF的抗体中72%均可检出中和活性且亲和力较高。此外，多数（73/98）中和抗体的表位同时存在于preF和postF上，即，尽管可结合preF的抗体大多数是preF特异性的，但其中仅少量具备中和活性。 

　　接下来，作者将初始中和实验中表现出中和活性的98个抗体的浓度降低至0.1μg/ml，发现其中30个依然具备50%以上的中和活性，测得其半数最大中和浓度（IC₅₀）在0.012~0.243 μg/ml之间。进一步地，作者发现其中7株抗体具备广谱中和多个hMPV亚型的能力，且IC₅₀小于0.1μg/ml，但它们均不能交叉结合RSV F，说明可交叉结合hMPV/RSV的高效中和抗体几乎不可能由天然感染诱发。 

　　作者随后通过竞争试验分析抗体的结合表位，选定几株抗体作为对照：靶向F三聚体基部位点I的DS7、靶向位点II螺旋-环-螺旋基序的MPV234、靶向三聚体顶端及单体间部分界面的MPV458，及交叉结合RSV的抗体ADI-61105（靶向保守位点III）和ADI-61153（靶向保守位点IV）。此外，在竞争实验中还发现一组抗体（14%，48/341）专一性与抗体ADI-61128竞争，而不与前述几种抗体竞争，经冷冻电镜3D重建分析发现其表位位于三聚体内部，介于位点II和MPV458表位之间，该表位只有在三聚体发生“呼吸”（即单体间结合变得较为松散）或解聚时才会暴露^[3]。 

　　通过与上述6种抗体进行竞争实验，282个抗体呈现出7组不同的竞争组（A-G），每组至少包含10个抗体。不同供者和年龄间未显示出抗体结合比例的差异，表明反复暴露hMPV和/或免疫衰老不会实质性影响B细胞的免疫优势层次结构。绝大部分（91%）抗体可同时结合preF和postF，大部分（75%）具有中和活性。B组抗体是优势类群，原因是：相当比例（42/98）的高效中和抗体属于B组，包括3/7的交叉中和抗体，3/10可交叉结合RSV的抗体也属于这个组，说明B组靶向的表位IV是保守的。剩余的中和抗体分属C组和E组，分别对应抗体234（位点II）和ADI-61105（位点III）的表位。而A、D、F、G组的抗体几乎或完全不具备中和活性，说明上述表位不易被中和抗体接触。综合上述结果，hMPV的中和抗体是高度表位依赖的，大部分中和抗体靶向F前后融合态共有的表位。 

　　下面作者聚焦一个特异性结合preF的高效中和抗体ADI-61026。竞争实验显示仅有10个抗体与其表位有重叠，其中8个还与MPV458和ADI-61105存在竞争，但ADI-61026与其余的高效中和抗体均不存在竞争。以上情况说明ADI-61026识别的是一个罕见的表位，靠近F三聚体顶端的MPV345表位。为揭示其分子细节，作者使用冷冻电镜解析出ADI-61026和MPE8的Fab与hMPV F三聚体的结构，整体分辨率达到3.5？，MPE8是一个可以交叉结合RSV/hMPV的抗体^[4]。电子密度图显示，ADI-61026 Fab结合在F三聚体顶端的？表位。具体结构显示，ADI-61026的重链和轻链都通过极性和疏水作用参与结合F。不同hMPV分离株上对应ADI-61026表位的序列显示出高度保守性，仅存在两个氨基酸（Lys175、Lys179）的变异，且仅其中的Lys179参与结合抗体。结构模拟显示突变体K179R仍维持与抗体的相互作用，这也可以解释ADI-61026为何显示出跨亚型的中和活性。此外，作者还将ADI-61026表位定位在hMPV postF结构上，发现其结构被完整打乱。 

　　最后测试抗体的在体（in vivo）保护效果。作者选择3株抗体（ADI-61026、ADI-61104、ADI-61556），测试其在棉花大鼠中被动传输及攻毒保护情况。三株抗体分别靶向不同的表位：ADI-61026靶向？表位，ADI-61104结合一个与表位I和III部分重叠的位点，AID-61556识别跨表位II和III的位置。大鼠经肌肉注射1mg/kg剂量的抗体，24小时后经鼻攻毒hMPV，四天后处死小鼠分析肺和鼻组织中的病毒载量。三组测试鼠肺部的病毒mRNA降低10至20倍，但仅ADI-61026或ADI-61556组的鼻部病毒复制出现明显降低，ADI-61104组未能降低鼻腔病毒载量。因此，从健康成年人中分离到的高效中和抗体可以在小动物模型中提供对hMPV感染的强效预防保护效果。 

　　回顾全文，作者通过单细胞高通量测序自健康供者体内分离到大量靶向hMPV F的抗体，其中具有中和活性的抗体主要靶向preF与postF共有的保守表位，结构分析显示一株高效中和抗体靶向preF三聚体顶端的罕见表位，3株靶向不同表位的抗体均可分别在小动物水平提供保护效果。该研究为hMPV的治疗提供人源抗体储备，也为疫苗的理性设计提供结构信息。 

   （来源：BioArtMED） 

　　参考文献： 

　　1. Anderson, E.J., Sim？es, E.A., Buttery, J.P., Dennehy, P.H., Domachowske, J.B., Jensen, K., Lieberman, J.M., Losonsky, G.A., and Yogev, R. (2012). Prevalence and characteristics of human Metapneumovirus infection Among hospitalized children at high risk for severe lower respiratory tract infection. J. Pediatr. Infect. Dis. Soc. 1, 212–222 

　　2. Huang, J., Diaz, D., and Mousa, J.J. (2019). Antibody epitopes of Pneumovirus fusion proteins. Front. Immunol.10, 2778 

　　3. Huang, J., Diaz, D., and Mousa, J.J. (2020). Antibody recognition of the Pneumovirus fusion protein trimer interface. PLoS Pathog. 16, e1008942 

　　4. Wen, X., Mousa, J.J., Bates, J.T., Lamb, R.A., Crowe, J.E., Jr., and Jardetzky, T.S. (2017). Structural basis for antibody cross-neutralization of respiratory syncytial virus and human Metapneumovirus. Nat. Microbiol. 2, 16272.