中国医学科学院病原所与德国海德堡大学合作揭示甲型肝炎病毒2C蛋白的结构及核酸酶活性
近日，中国医学科学院病原生物学研究所崔胜研究团队与德国海德堡大学Volker Lohmann研究团队在Nucleic Acids Research杂志在线发表了题为“Biochemical and Structural Characterization of Hepatitis A Virus 2C Reveals an Unusual Ribonuclease Activity on Single-Stranded RNA”的论文。研究人员首次解析了甲型肝炎病毒（HAV）2C蛋白的高分辨率晶体结构（2.2 ？），首次发现HAV 2C具有降解多聚尿苷酸单链核糖核酸（poly-U ssRNA）的核酸酶活性，证明了HAV 2C的核酸酶活性对病毒复制发挥着关键的作用。
迄今为止，HAV仍然是引起病毒学肝病的主要病原体之一。HAV属于小RNA病毒科（Picornaviridae），是肝炎病毒属中唯一的病毒，与其他病毒的差异较大。因此，HAV在病毒分子进化方面具有研究价值。
崔胜研究团队长期研究各种小RNA病毒2C蛋白的结构、功能及其在病毒复制中的作用[1]。他们系统研究了EV71 2C（Sci Adv . 2017 Apr 28;3(4):e1602573.），PV 2C（PLoS Pathog. 2018 Sep 19;14(9):e1007304.）和FMDV 2C（Cell Rep. 2022 Jul 5;40(1):111030.）的结构、功能，揭示了2C通过其C末端结构域发生自我多聚的结构基础，证明了2C的自我多聚与其ATP酶活性、病毒复制密切相关。据此，他们提出干扰2C多聚，抑制病毒复制的抗病毒新策略；并在细胞、动物水平验证了该策略的可行性[2-4]。
在这篇最新发表的论文中，研究人员选择小RNA病毒家族中进化差异最大的病毒HAV，开展深入研究，希望综合以往的系列研究成功，揭示2C分子进化特征。他们解析了HAV 2C蛋白2.2 ？分辨率的晶体结构，发现HAV 2C包含一个典型的ATP酶结构域、一个类似肠道病毒2C蛋白锌指结构（ZFER）和一个C-末端螺旋结构域（PBD）（图1）。与其他小RNA病毒2C相似[2,3]，HAV 2C也通过PBD-Pocket相互作用发生自我多聚。基于HAV 2C结构，利用ATP酶实验、BLI和HAV复制子等实验体系，研究人员系统研究了ATPase、Pocket、PBD和ZFER结构域在2C活性以及病毒复制发挥的作用。
图1 HAV 2C的晶体结构，2C保守结构域在ATP酶活性、病毒复制中的作用。
令人意外的是，研究人员发现HAV 2C不仅具有ATP酶活性，还具有核糖核酸酶（RNase）活性（图2）。HAV 2C能够降解多种RNA底物，包括3’和5’末端突出的双链RNA、单链RNA以及泡状双链RNA，但不降解DNA。此外，HAV 2C的核酸酶活性对单链、多聚尿苷酸底物表现出明显偏好性。利用体外突变实验和HAV复制子，研究人员找到了2C核酸酶活性中心及关键氨基酸（ASP，GLU等），证明了核酸酶活性与2C的ATP酶无关联。敲除核酸酶活性严重损害HAV的复制效率。最终，他们还发现EV71 2C，PV 2C，CVB3 2C，FMDV 2C，EV-D68 2C和HRV 2C等一系列小RNA病毒2C均具有类似活性。为了排除环境非特性核酸酶污染对实验结果的影响，研究人员设计、制备了大量2C核酸酶突变体，验证了他们的研究结果。核酸酶活性在小RNA病毒复制中扮演的角色尚需在后续工作中阐明。
图2 HAV 2C是一种可特异性降解U-rich的ssRNA区域的核糖核酸酶
HAV 2C与其他小RNA病毒2C的氨基酸序列差异较大，同源性仅~25%。然而，HAV 2C仍然保留了C-末端结构域介导的自我多聚（图3），说明这是一个泛小RNA病毒（pan-Picornavirus）的保守特征。因此，干扰2C自身多聚有可能成为广谱抗病毒的通用策略。
图3C-末端结构域介导的2C自我多聚是一个泛小RNA病毒的保守特征
中国医学科学院病原生物学研究所崔胜和德国海德堡大学Volker Lohmann为本文的共同通讯作者，崔胜课题组博士研究生陈埔、瑞士光源Justyna Wojdyla、海德堡大学博士研究生Ombretta Colasanti和崔胜课题组的李智剑为本文的共同第一作者。该研究获得了中国医学科学院医学科技创新工程、国际基因工程与生物技术中心合作研究计划（ICGEB-CRP）和多个国家自然科学基金等项目的连续资助。
（来源：中国病毒学论坛）
参考文献：
1.Chen, P., Z. Li, and S. Cui, Picornaviral 2C proteins: A unique ATPase family critical in virus replication. Enzymes, 2021. 49: p. 235-264.
2.Guan, H., et al., Crystal structure of 2C helicase from enterovirus 71. Sci Adv, 2017. 3(4): p. e1602573.
3.Guan, H., et al., Crystal structure of a soluble fragment of poliovirus 2CATPase. PLoS Pathog, 2018. 14(9): p. e1007304.
4.Zhang, C., et al., An anti-picornaviral strategy based on the crystal structure of foot-and-mouth disease virus 2C protein.Cell Rep, 2022. 40(1): p. 111030.
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